Brookfield hade lämnat ett icke-bindande bud på Grifols den 19 november som värderade den plasma-baserade läkemedelsutvecklaren till 6,45 miljarder euro (6,79 miljarder dollar), vilket Grifols då sade var ett erbjudande som väsentligt undervärderade bolaget och rekommenderade aktieägarna att behålla sina aktier.
Grifols aktie stängde ned 9,07 procent på onsdagen, efter att ha fallit mer än 12 procent i den tidiga handeln efter att Bloomberg förhandstittat på Brookfields beslut.
Brookfield hade i september uttryckt sitt intresse för att lägga ett uppköpserbjudande tillsammans med Grifols-familjen, förutsatt att due diligence-processen hade slutförts framgångsrikt.
En talesman för Grifols grundarfamilj hade tidigare bekräftat Brookfields tillbakadragande.
Grifols sade efter tillkännagivandet att man inom kort kommer att utlysa en investerardag där man kommer att presentera sin strategiska vision och "nyckelinitiativ för att tillvarata tillväxtmöjligheter".
"Grifols styrelse och ledningsgrupp är fortsatt fullt engagerade i genomförandet av bolagets strategiska plan, som syftar till att öka det långsiktiga värdet", sade hon.
Det är oklart om familjen och Brookfield kan återuppta samtalen vid ett senare tillfälle.
(1 dollar = 0,9505 euro)
(Rapportering av Joan Faus, Inti Landauro, David Latona och Andres Gonzalezd; redigering av Louise Heavens, Jonathan Oatis och Chizu Nomiyama; spansk utgåva av Tomás Cobos)